وفقدت ابنها الوحيد عام ١٤٩٧، وهو أملها الوحيد في وراثة طبيعية للعرش، كما ماتت أحب بناتها عام ١٤٩٨، وهي ملكة البرتغال، التي ربما وحدت شبه الجزيرة توحيداً سلمياً لو قدرت لها الحياة. وكابدت وسط هذه الضربات المأساة اليومية وهي تشاهد ابنتها جوانا، التي كانت وقتذاك ولية للعهد، تفقد عقلها ببطيء.
وكانت جوانا قد تزوجت فيليب الجميل، دوق برجندي وابن الإمبراطور مكسيمليان الأول (١٩٤٦) وأنجبت منه إمبراطورين مقبلين هما شارل الخامس وفرديناند الأول. وأهمها زوجها فيليب إما لمزاجها المتقلب، أو لسفاهتها، واستمر على اتصال بإحدى سيدات بلاطها في بروكسل، وجزت جوانا شعرها الخلاب فأقسم زوجها ألا يضاجعها-وسمعت إيزابلا بهذا كله. فوقعت مريضة وفي الثاني من أكتوبر عام ١٥٠٤ كتبت وصيتها. بأن يحتفل بجنازتها أبسط احتفال وأن المال المدخر من هذا الصنيع يجب أن يوزع على الفقراء، وأن تدفن في دير فرنسسكاني داخل الحمراء، وأضافت: ولكن إذا رأى مولاي الملك أن يكون جدثه في مكان آخر وصيتي أن ينقل جثماني إلى جواره، وأن الاتحاد الذي نعمنا به في هذه الدنيا، وقد تقتضي رحمة الله أن تتحد معاً روحانا مرة أخرى في الآخرة، ويمثله اتحاد جسمينا في الثرى" وماتت في الخامس عشر من نوفمبر عام ١٥٠٤ ودفنت كما أوصت، حتى إذا مات فرديناند نقل جثمانها ليدفن إلى جواره في كتدرائية غرناطة. وكتب بيتر مارتير "لقد فقدت الدنيا أنبل زينتها، لا أعرف أحداً من جنسها في العصور القديمة أو الحديثة، جديرة على الإطلاق بأن يوضع اسمها مع هذه المرأة التي لا تضارع". (لقد كانت مرجريت ملكة السويد بعيدة عن مجال إدراكه، كما أن إليزابث ملكة إنجلترا كانت كذلك لم تأت بعد).
وقد عينت وصية إيزابلا، فرديناند ليكون نائب ملك على قشتالة